1143 細菌內(nèi)毒素檢查法修訂草案公示稿（第二次）

 1143 細菌內(nèi)毒素檢查法

本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。

細菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。可采用凝膠檢測和光度檢測技術，共包括以下六種方法：凝膠限度法（方法 1）、凝膠定量法（方法 2）、動態(tài)濁度法（方法 3）、終點濁度法（方法4)、動態(tài)顯色法（方法 5）、終點顯色法（方法 6）。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠限度法結果為準。

本試驗操作過程應防止內(nèi)毒素的污染。

細菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）表示，1EU 與 1 個內(nèi)毒素國際單位（IU）相當。

細菌內(nèi)毒素國家標準品系自大腸埃希菌提取精制，并以細菌內(nèi)毒素國際標準品標定其效價，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度、標定細菌內(nèi)毒素工作標準品的效價，干擾試驗及檢查法中編號 B 和 C 溶液的制備、凝膠法中鱟試劑靈敏度復核試驗、光度測定法中標準曲線可靠性試驗。

細菌內(nèi)毒素工作標準品系以細菌內(nèi)毒素國家標準品為基準標定其效價，用于干擾試驗及檢查法中編號 B 和 C 溶液的制備、凝膠法中鱟試劑靈敏度復核試驗、光度測定法中標準曲線可靠性試驗。

細菌內(nèi)毒素檢查用水應符合滅菌注射用水標準，其內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法檢測技術）或小于 0.005EU/ml（用于光度法檢測技術）,且對內(nèi)毒素檢查法試驗無干擾作用。

鱟試劑是從鱟的血液變形細胞中提取制備中提取出的凍干試劑，可以與細菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應。除了內(nèi)毒素，鱟試劑還與某些β-葡聚糖反應，產(chǎn)生假陽性結果。如遇含有β-葡聚糖的樣品，可使用去 G 因子鱟試劑或 G 因子反應抑制劑來排除鱟試劑與β-葡聚糖的反應。

試驗所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃、至少 30 分鐘）去除，也可采用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器具。

供試品溶液的制備 某些供試品一般采用溶解和（或）稀釋等適宜方法或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。必要時，可調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH 值，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的 pH 值在 6.0～8.0 的范圍內(nèi)為宜，可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖液調(diào)節(jié) pH 值。酸或堿溶液須用細菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。所用溶劑、酸堿溶液及緩沖液應不含內(nèi)毒素和干擾因子。

內(nèi)毒素限值的確定 藥品、生物制品細菌內(nèi)毒素限值（L）一般按以下公式確定： L=K/M式中 L 為供試品的細菌內(nèi)毒素限值，一般以 EU/ml、EU/mg 或 EU/U（活性單位）表示；K 為人每千克體重或每平方米體表面積每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以 EU/（kg·h）表示，注射劑 K=5EU/（kg·h），放射性藥品注射劑 K=2.5EU/（kg·h）注1，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/（kg·h），按體表面積給藥時K=100EU/

（m 45 2·h）；M 為人用每千克體重或每平方米體表面積每小時的最大供試品劑量，以 ml/

（kg·h）、mg/（kg·h）、或 U/（kg·h）、ml/（m 47 2·h）等表示，人均體重按 60kg 計算，人體表面積按 1.62m 48 2計算。注射時間若不足 1 小時，按 1 小時計算。供試品每平方米體表面積劑量乘以 0.027 即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量（M）。

按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。

確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD） 最大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。用以下公式來確定 MVD：

MVD=cL/λ3 / 10

式中 L 為供試品的細菌內(nèi)毒素限值；

c 為供試品溶液的濃度，當 L 以 EU/mg 或 EU/U 表示時，c 的單位需為 mg/ml或 U/ml，當 L 以 EU/ml 表示時，則 c 等于 1.0ml/ml。如需計算在 MVD時的供試品濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式 c=λ/L；

λ為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度（EU/ml），或是在光度測定法中所使用的標準曲線上最低的內(nèi)毒素濃度。

方法 1 凝膠法檢測技術（包括方法 1 和方法 2）凝膠法檢測技術系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的原理進行限度檢測或半定量檢測內(nèi)毒素的方法。

 1.預備試驗

為保證凝膠法的準確性和有效性，按以下步驟開展鱟試劑靈敏度復核試驗和供試品的干擾試驗。

鱟試劑靈敏度復核試驗 在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用 EU/ml 表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。

來源：藥委會

附件 1143 細菌內(nèi)毒素檢查法修訂草案公示稿（第二次）.pdf