9104近紅外分光光度法指導原則

近紅外分光光度法系通過測定物質在近紅外光譜區(波長范圍約在780~2500nm,按波數計約為12800~4000cm-)的特征光譜并利用化學計量學方法提取相關信息，對物質進行定性、定量分析的一種光譜分析技術。近紅外光譜主要由C-H、N-H、O-H和S-H等基團基頻振動的倍頻和合頻組成由于其吸收強度遠低于物質中紅外光譜(4000~400cm-1)的基頻振動，而且吸收峰重疊嚴重，因此通常不能直接對其進行解析，而需要對測得的光譜數據進行數學處理后，才能進行定性、定量分析。

應用范圍

近紅外分光光度法具有快速、準確、對樣品無破壞的檢測特性，不僅能進行"離線“分析,還能直接進行"在線”“過程控制;不僅可以直接測定原料和制劑中的活性成分，還能對藥品的某些理化性質如水分、脂肪類化合物的羥值、碘值和酸值等進行分析;并能對藥物輔料、中間產物以及包裝材料進行定性和分級。

儀器裝置

1.儀器

近紅外分光光度計由光源、單色器(或干涉儀)、采樣系統、檢測器、數據處理器和評價系統等組成。常采用高強度的石英或鎢燈光源,但鎢燈比較穩定;單色器有聲光可調型、光柵型和棱鏡型;樣品池、光纖探頭、液體透射池、積分球是常用的采樣裝置;硅、硫化鉛、砷化銦、銦鎵砷、汞鎘確和氘代硫酸三甘肽檢測器為常用的檢測器。檢測器和采樣系統需根據供試品的類型選擇。

2.儀器性能的校驗與自檢

為確保儀器能達到預期的應用目的，應采用標準參比物質(SRM)對儀器的性能定期進行校驗，并在使用中通過自檢確保儀器的適用性。近紅外光譜儀的校驗參數通常包括波長的準確度、吸收/反射度的精密度、線性及最大和最小光通量處的噪聲。近紅外光譜儀的自檢通常通過比較實測光譜與校驗時儲存于儀器中的標準光譜的差異來實現。自檢時除針對上述校驗參數設計適當的指標外，還應考慮分析過程中波長的漂移和靈敏度的改變。

儀器的校驗除應定期進行外，當維修光路或更換光學部件如光源或采樣附件后也,應進行。推薦用于藥物分析的近紅外光譜儀校驗參數見下表。

①通常在2500nm(4000cm-1)處儀器允許的最大漂移為10nm(16cm-1)。

②SRM1920a是美國NIST提供的用于近紅外波長校正的標準物質,通過SRM1920a對儀器1935nm處的光譜峰進行校準，來確定波長的準確性。

③AOBS指觀測的吸光度，AREF指反射標準物質在3個特定波長處的吸光度

測量模式

近紅外光譜分析中常采用透射或反射測量模式。

1.反射模式(又稱漫反射模式)

反射模式主要用于分析固體樣品，近紅外光可穿至樣品內部1~3mm，未被吸收的近紅外光從樣品中反射出。分別測定樣品的反射光強度(I)與參比反射表面的反射光強度(L)，其比值為反射率R。Ig(1/R)與波長或波數的函數為近紅外光譜。

R=J/L

AR=lg(1/R)=Ig(H/I)

固體樣品的顆粒大小、形狀、緊密程度及其他物理性質均會引起光譜基線的漂移,因此不是所有的固體混合物均符合比爾定律?？捎脭祵W方法減弱或消除粒度的影響。最常用的數學方法為對光譜進行導數處理。當樣品量足夠大時，也可用多元散射校正方法處理數據。

2.透射模式

透射模式主要用于分析液體樣品，近紅外光穿過樣品，透射光強度(I)與波長或波數的函數為近紅外光譜。測定樣品時樣品置于光源與檢測器之間的光路上，結果直接以透光率(7)或吸光度(A)表示。

T=I/L6

A=-lgT=lg(1/T)=lg(I/I)

式中 兒為入射光強度。

透射-反射模式為透射與反射模式的結合，將反射鏡置樣品的后部,光源與檢測器在樣品的同側，近紅外光穿過樣品后經反射鏡返回,因此光程增加為兩倍。

四、影響近紅外光譜的主要因素

環境溫度、樣品的光學性質、多晶型、樣品的含水量和溶劑殘留量、樣品厚度、硬度、光潔度及樣品的貯存時間等均對樣品的近紅外光譜有影響。液體樣品對環境溫度最敏感，不同晶型的樣品通常具有不同的近紅外光譜。

五、應用近紅外分光光度法進行定性、定量分析的基本要求

(一)定性分析

利用近紅外分光光度法進行定性分析的主要步驟包括:收集代表性樣品,測定光譜,選擇化學計量學方法對圖譜進行預處理和降維處理，建立定性分析模型，對模型進行驗證。

1.代表性樣品的選擇

選擇適宜的代表性樣品(如不同的生產工藝、物理形態、粒度分布等)建立定性分析模型。模型中各類樣品的性質決定了模型的適用范圍。

2.圖譜預處理和降維處理

為有效地提取有用信息，排除無效信息，在建立分類或校正模型時需要對譜圖進行數學預處理。歸一化處理常用于消除或減弱由位置或光程變化所導致的基線平移或強度變化，導數處理可以提音語圖的分辨率,但導數處理的同時擴大了噪聲,因此常輔以平滑處理來消除噪聲:對固體樣品，采用多元散射校正(MSC)或標準正態變量變換(SNV)校正可以消除或減弱光散射引入的基線偏移。

多元近紅外光譜數據包含有大量的相關變量(共線性),建模時需要減少變量,即用一組新的不相關但包含相應信息的變量來代表所有數據的變化建立模型。常用的減少變量的方法是主成分分析(PCA)法。

3.建立定性分析模型

建立定性分析模型就是將樣品的性質與光譜的變化相關聯,用光譜的差異程度來區分樣品的性質。定件分析中常采用模式識別的方法對具有相似特征的樣品進行分組。模式識別方法包括判別分析和聚類分析。判別分析要求對樣本的類別特征有明確的定義，并按定義區分樣本;而聚類分析適用于僅需要對樣本進行分組而不需要預先知道這些樣品彼此間的確切關系。

4.模型的驗證

對定性分析模型，至少應進行模型的專屬性和重現性兩方面的驗證，

(1)專屬性模型的專屬性通常用對已知樣品的鑒別正確率表示。不僅需要驗證真品的鑒別正確率,還需要用化學結構或性質上與模型中物質相近的樣品進行挑戰性驗證，證明模型能區分出這些物質。

(2)耐用性模型的耐用性系指在不改變模型參數的情況下,考査正常操作中的微小變化對模型預測結果的影響。通常包括①不同操作者的影響;

②環境條件(如實驗室中的溫度、濕度變化)的影響

③操作(如樣品在光學窗口的位置、液體探頭的測量深度、包裝狀況)的影響;

④儀器部件的更換。

(二)定量分析

利用近紅外分光光度法進行定量分析的主要步驟包括:收集樣品并進行檢驗，選擇代表性樣品,測定光譜,選擇化學計量學方法對圖譜進行預處理和降維處理，建立定量分析模型，對模型進行驗證。

1.代表性樣品的選擇

根據樣品的收集及檢驗情況，選擇能包括全部樣品理化性質差異的適宜數量的樣品作為建模樣品。建模樣本的含量范圍應該寬于預測樣品的范圍,必要時可以通過加速實驗或特殊制備的方式獲得。

2.圖譜預處理和降維處理參見”定性分析”

3.建立定量分析模型

近紅外光譜測量時一般不需要對樣品進行預處理,但測量時可受多種因素的影響,利用單波長光譜數據很難獲得準確的定量分析結果。現代近紅外光譜定量分析均利用多波長光譜數據，采用多元校正的方法,如多元線性回歸(MLR)、主成分回歸(PCR)、偏最小二乘回歸(PLSR)和人工神經網絡(ANN)等建立分析模型。

4.方法學驗證

近紅外分光光度法定量分析的方法學驗證與其他分析方法的要求相似。每個被驗證參數可被接受的限度范圍與該方法的應用目的有關，通常應考慮專屬性、線性、準確度、精密度和重現性。

六、近紅外模型的再驗證

當預測物質的物理性質改變，或物質的來源改變，如產品的組成、生產工藝、原(輔)料的來源或級別發生改變時,需要對已建立的定量模型進行再驗證。必要時應對模型進行維護或建立新模型。

七、近紅外模型的傳遞

近紅外模型的傳遞表示模型在不同的近紅外光譜儀中的適用情況。當近紅外模型在非建模儀器中應用時，必須考慮儀器型號、數據格式、光譜范圍.數據點數量、光譜分辨率等對模型的影響。用適宜的代表性樣品(數量依據具體模型確定)分別在建模儀器(源機)和其他儀器掃描光譜，分別利用不同儀器上獲得的光譜預測結果，并進行統計學檢驗，以確證該模型在其他儀器中使用是否有效。

來源：藥典委