9106 基于基因芯片的藥物評價技術與方法指導原則

本指導原則規定了將基因芯片技術用于藥物安全性和有效性評價的原理、定義、主要技術指標和待測樣品的要求、樣品圖譜的制作及分析方法。目的是規范基于基因枝片技術的藥物安全性、有效性評價研究,,為該類研究的實驗設計、方法學建立等過程和測定方法的適用范圍提供指導性的原則要求。

一、定義及原理

藥物基因組學(pharmacogenomics),又稱基因組藥物學或基因組藥理學,是藥理學的一個分支,定義為在基因組學的基礎上,通過將基因表達或單核苷酸的多態性與藥物的療效或毒性聯系起來，研究藥物如何由于遺傳變異而產生不同的作用,。

毒理基因組學(toxicogenomics)是從多基因、全基因組水平研究毒物作用與基因表達的相互影響,其研究內容主要包括3個方面:促進環境應激原與疾病易感性關系的理解、闡明毒性分子機制、篩選和確認與疾病和毒物暴露相關的生物標志物(biomarkers)。

DNA微陣列(DNA microarray)又稱DNA陣列或DNA芯片,比較常用的名字是基因芯片(gene chip)。是一塊帶有DNA微陣列(microaray)的特殊玻璃片或硅芯片，在數平方厘米的面積上布放數千或數萬個核酸探針;樣品中的DNA、CDNA、RNA等與探針結合后,借由熒光或電流等方式檢測每個探針分子的雜交信號強度,進而獲取樣品分子的數量和序列信息。經由一次測定,即可提供大量基因序列相關信息,以高通量、多因素、微型化和快速靈敏的特點而見長。

原理:利用生物分子相互間的特導識別作用進行生物信號處理

根據檢測樣本的不同，基因芯片可分為表達譜芯片(CDNA芯片)、SNP(單核苷酸多態性,singlenucleotide polymorphism)芯片、miRNA芯片、SiRNA芯片、染色質免疫共沉淀芯片(chromatin immunoprecipitation-chip,CHIP-chip)和DNA甲基化芯片(MeDIP-chip)等

二、基本原則

基于基因組學技術的藥物安全性、有效性評價方法應符合藥物基因組學研究的隨機、對照、重復的基本原則;具備簡單、精確的特點;應有明確的判斷標準。

三、基本內容

1.生物樣本的獲取

試驗系的選擇 基于基因芯片技術的藥物安全性、有效性評價方法中所用的試驗系,包括整體動物、離體器官、血清、組織、細胞等。試驗系的選擇與試驗原理和測定指標密切相關，應選擇背景資料清楚、影響因素少、檢測指標靈敏和成本低廉的試驗系統。應盡可能研究各種因素對試驗系的影響，采取必要的措施對影響因素進行控制。

如采用實驗動物,盡可能使用大鼠和小鼠等來源多,成本低的實驗動物,并說明其種屋、品系、性別和周齡。實驗動物的使用應道循"優化、減少、替代"的"3R"原則。

供試品選擇 應選擇工藝穩定，質量合格的供試品。應至少使用3批供試品。若為飲片，應基源清楚。

標準品或對照品選擇 采用標準品或對照品均應有理論依據和/或實驗依據。國家標準中采用的標準品或對照品的使用應符合國家有關規定要求

2.生物實驗設計

設計原理 所選實驗方法的原理應明確，檢測指標靈敏度高，客觀、專屬性強。

設計類型 試驗設計可考慮設供試品組、陰性對照組或陽性對照組，使用動物模型應考慮設置模型對照組，對于重現性好的試驗,可不設或僅在復試時設陽性對照組，

劑量設計 按照生物檢定的要求，參照藥物臨床用藥劑量進行合理的劑量設計，試驗劑量的選擇以產生采用基因芯片能檢測到生物效應為宜;在制訂質量標準研究中，應采取多劑是試驗，并充分說明標準中設定限值劑量的依據 

給藥途徑 與臨床用藥途徑一致。如采用不同的給藥途徑，應說明理由，

給藥次數 根據藥效學研究合理設計給藥次數，可采用多次或單次給藥,盡量與臨床用藥給藥次數一致

指標選擇 應客觀、明確、專屬，與藥物藥效或安全性相關。

生物祥本處理 應盡量使用無菌、一次性型料制品，已標明不含有核糖核酸酶(RNase-free)且未開封過的型料制品;在試劑中可適當加入一定量的RNA穩定劑;盡量確定每次處理樣本的最大數量,減少處理過程對RNA整體性的影響:需要對影響RNA質量的多個因素進行評價:如樣品量等。在收集到生物樣本后，最好能即刻進行RNA制備工作,若需暫時儲存,則應以液氨將生物樣本急速冷凍后,儲存于-80℃冰箱中。在制備RNA時,將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細胞。不可先行解凍，以避免RNase的作用。

3,基因芯片技術

為了基因林片分析數據的準確、穩定和可靠,應建立并嚴格執,行基因林片技術的標準操作規程(SOP)。基于基因芯片技術的藥物安全性、有效性評價方法主要包括:基因芯片制備、樣本獲取、總RNA提取(extraction)、體外擴增(amplification)、標記(labeling)、芯片雜交(hybridization)、洗滌(wash)、差異基因檢測、分析及驗證,以下內容詳細說明各流程中的主要原理及注意事項

RNA提取、分離和制備 RNA的提取主要包括組織、細胞、全血或外周加單核細胞(PBMCS)中RNA的提取，常見的RNA提取方法有TRIZOl法、苯酚法和胍鹽/-巰基乙醇法等;提取的總RNA采用RNA純化試劑盒純化,純化后不應存在對逆轉錄酶等有抑制作用的物質，排除有機溶劑和金屬離子的污染，盡量避免蛋白質、多糖和脂類分子等污染。

基因芯片的制備 以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或CDNA作為探針按順序排列在載體上。

熒光標記 在基因組DNA擴增過程中,將帶有Cv3或Cv5英光素的dUTP或dCTP加入到新合成的DNA鏈,使新合成的DNA鏈帶有熒光標識。

雜交和洗滌 使帶有熒光標記gDNA/CDNA與基因芯片上的探針進行特異性互補結合的過程稱為雜交。

基因芯片掃描(microarray scanning) 將雜交后的基因芯片置于芯片掃描儀內獲得不同探針雜交信號強度的全貌圖

基因芯片數據分析 采用圖像分析軟件對芯片圖像進行分析,將圖像信號轉化為數字信號,對芯片上的數據采用局部加權回歸散點平滑法(locallvweighted scatter plot smoothing,LOWESS或LOESS)進行歸一化,根據Cy3或Cy5信號強度和比值判斷差異基因。采用實時英光定量PCR對差異表達基因定量，驗證差異表達基因。

4.方法學驗證

(1)測定方法影響因素 應考察測定方法的各種影響因素,確定最佳的試驗條件,以保證試驗方法的專屬性和準確性。根據對影響因素考察結果,規定方法誤差控制限值或對統計有效性進行說明。

(2)精密度考察  應進行重復性、中間精密度、重現性考察。

重復性 按確定的測定方法，至少用3批供試品、每批3次或同批供試品進行6次測定試驗后對結果進行評價。基因芯片測定試驗結果判斷應基本一致。

中間精密度 考察試驗內部條件改變(如不同人員、不同儀器、不同工作日和實驗時間)對測定結果的影響

重現性 基因芯片測定試驗結果必須在3家以上實驗室能夠重現。

(3)方法適用性考察 按擬采用的基因林片測定方法和劑量對10批以上該產品進行測定,以積累數據，考察質量標準中該測定項目的適用性。

來源：藥典委