人用重組DNA蛋白制品總論

1 概述

人用重組DNA蛋白制品是采用重組DNA技術,對編碼所需蛋白質的基因進行遺傳修飾,利用質粒或病毒載體將目的基因導入適當的宿主細胞，表達并翻譯成蛋白質，經過提取和純化等步驟制備而成的具有生物學活性的蛋白質制品，用于疾病的預防和治療。

本總論是對治療用人用重組DNA蛋白制品生產和質量控制的通用性技術要求，縣體品種還應符合本版藥典各論的要求。

2 制造

2.1 基本要求

人用重組DNA蛋白制品的制造主要包括工程細胞的制備、發酵或細胞培養，目的蛋白質的提取和純化、制劑等過程。工程細胞的來源、管理及檢定應符合“生物制品生產檢定用菌毒種管理及質量控制"和“生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及質量控制"的相關要求。生產過程中使用的原材料和輔料應符合相關要求。應采用經過驗證的生產工藝進行生產，并對生產工藝全過程進行控制，

2.2工程細胞的控制

應建立細胞種子、主細胞庫及工作細胞庫。一般情況下主細胞庫來自細胞種子,工作細胞庫來自主細胞庫。主細胞庫和工作細胞庫均應有詳細的制備過程、檢定情況及管理規定，并應符合“生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及質量控制"的相關要求,

2.2.1表達載體和宿主細胞

應描述宿主細胞和表達載體的起源、來源、遺傳背景,包括克隆基因的來源和特性、構建和鑒別情況，以及表達載體遺傳特性和結構等詳細資料，同時應說明表達載體來源和各部分的功能.

應詳細描述表達載體擴增、對宿主細胞的轉化方法、生產用細胞克隆的篩選標準及其在宿主細胞中的位置、物理狀態和遺傳穩定性資料。應明確克隆基因、表達載體控制區及其兩側、與表達或產品質量相關的核苷酸序列，以及在生產過程中控制、提高表達水平的各種措施。

2.2.2細胞庫系統

通常包括主細胞,庫和工作細胞庫。主細胞庫是由含目的基因表達載體轉化的細胞種子經傳代擴增制成的均一懸液,分裝于單獨容器中用于貯存。工作細胞庫是從主細胞庫經有限傳代擴增制成的均一是液，并分裝于單獨容器中用于貯存。所有的貯藏容器應在相同條件下要善保管,一旦取出使用，不

得再返回庫內保存。應詳細記錄細胞庫類型、容量、預期使用頻率下的壽命、保存容器、凍存劑、培養墓、冷凍保存步驟和貯存條件等信息，并提供庫存細胞穩定性的證據。

2.2.3細胞庫的質量控制

應對主細胞庫的表型和基因型標記進行鑒定。應采用分子生物學或其他適合的技術對表達載體基因拷貝數、基因插入或缺失、整合位點數量等情況進行分析。核苷酸序列應與表達載體一致，并與所預期的表達蛋白質的序列吻合。

應對細胞庫進行支原體、外源病毒因子等相關微生物污染的檢測，并確認細胞基質沒有被污染。已知攜帶內源逆轉錄病毒的嚙齒類細胞株，如CHO細胞等，已廣泛用于生產時，應采取風,險控制策略，在工藝中采用物理、化學等手段對其進行去除/滅活。主細胞庫應進行全面檢定，并符合要求;工作細胞庫可根據主細胞庫的檢定情況確定應檢定的項目，并符合要求,

2.2.4細胞基質的遺傳穩定性

應評估細胞基質的穩定性。應基于宿主細胞經長時間培養后表達產物分子的完整性，以及細胞基質表型和基因型特征的綜合情況，確定生產用細胞的最高限定代次。

長期發酵的多次收獲物會導致一些質量屬性的漂移,例如糖基化等。出現的"新”的變體可能會影響制品的質量、安全和有效性。這類漂移應在工藝驗證的研究中充分鑒定并明確控制策略。

2.3 生產過程的控制

生產工藝應穩定可控，并有明確的過程控制參數，以確保制品安全有效、質量可控。生產工藝的確定應建立在對目標制品的質量屬性、生產工藝的深入理解和全面設計的基礎上。應根據研發早期到規模化生產的整個工藝周期的相關信息,確定原液和成品生產的關鍵步驟并制定可接受標準進行控制，同時對其他確保工藝一致性的環節進行控制。適當的工藝過程控制能夠減少對原液和(或)成品常規檢測的需求。

2.3.1細胞培養

應對生產過程中使用的各種原材料進行質量控制，以保證這些原材料符合既定用途質量標準的要求。

2.3.1.1 有限傳代水平的生產

應限定生產過程中表達載體細菌或細胞傳代(或細胞群體倍增)的最高次數，最高限定代次的確定應基于細胞表型、基因型特性及其所表達基因的分子完整性、一致性，以及生產未期宿主細胞/載體的一致性研究，如質粒拷貝數及其在宿主細胞內的狀態，證明上述特征的試驗所涉及的傳代范圍應等于或超過規定的細胞最高限定代次。

應根據生產過程中培養、增殖和表達量一致性的研究資料，確定終止培養、廢棄培養物以及摒棄收獲物的技術參數。

2.3.1.2連續培養生產

采用細胞連續培養生產時應根據系統特點和穩定性以及培養期間產品一致性的研究資料，確定連續培養的最長周期以及培養周期全過程的監測要求包括生產過程中制品變異體或其他培養參數未超過標準限度的數據。應對收獲階段的微生物污染進行常規檢測，收獲物后續加工中批次的確定應清晰并易于追溯。應根據宿主載體系統的穩定性和制品特性等確定對細胞、制品進行再評估的時間間隔。

2.3.2提取和純化

制品的提取、純化主要依賴于各種蛋白質分離技術。采用的分離純化方法或技術，應能適用于規模化生產并保持穩定。應對純化工藝中可能殘存的有害物質進行嚴格檢測，這些組分包括固定相或者流動相中的化學試劑、各類親和色譜柱的脫落抗體或配基以及可能對目標制品關鍵質量屬性造成影響的各種物質等。

采用細胞培養或酵母等真核表達系統時，其蛋白質產物多為分泌性蛋白質,通常只需去除細胞或酵母即可初步獲得較高純度的目的蛋白:采用大腸埃希菌等原核表達系統時，菌體裂解后應盡快進行蛋白質純化。

純化工藝應保證對制品中的一些特定工藝雜質，包括來自表達載體的核酸,宿主細胞蛋白質、病毒等外源因子污染，細菌內毒素以及源自培養液的各種其他殘留物，必要時可采用特定的工藝將其去除或降低至可接受的水平生產工藝的優化應考慮殘留宿主DNA片段的大小，殘留量和對生物活件的影響。應采用適育的方式將殘留宿主DNA總量隆至可接受的水平，并就降低殘留宿主DNA片段的大小或者火活DNA活性的方式進行說明。

對于人和動物源的細胞基質，病毒去除/滅活工藝均應充分顯示能去除/滅活任何可能污染的病毒，確(保原液的安全性。滅活工藝應經驗證并符合要求。

2.3.3 原液

收獲液經提取、純化分裝于中間貯存容器中即為原液。如需加入穩定劑或賦形劑,應不影響質量檢定，否則應在添加輔料前取樣進行原液檢定。原液的檢測項目取決于工藝的驗證、一致性的確認和預期產品相關雜質與工藝相關雜質的水平。應采用適當方法對原液質量進行檢測，必要時應與標準物質進行比較。原液貯存應通過穩定性驗證確定貯存條件和時間。

2.3.4 半成品

可由一批或多批原液合并生產半成品。擬混合的每批原液應在有效期內目應符合擬制備制劑的有效期要求,每批原液應按規定的丅藝生產，單獨檢驗，并符合相應質量標準;不得將不合格批次與其他合格批次原液進行混合制備半成品;混合的各批原液應可有效追潮;應對混合工藝進行驗證。

除另有規定外，制備成品前，如需對原液進行稀釋或加入其他輔料制成半成品，應確定半成品的質量控制要求,包括檢定項目和可接受的標準

2.3.5 成品制劑

制劑生產應符合本版藥典和中國現行《藥品生產質量管理規范》的相關要求。

2.4 生產工藝變更

生產丁藝變更應符合國家藥品注冊管理等相關要求，涉及重大生產丅藝的變更，應對變更前后的制品質里，安全性和有效件進行比較和評估,以證明變更前后制品特性的高度相似，并確保任何質量屬性方面的改變對制品安全性和有效性無負面影響。

3 質量控制

人用重組DNA蛋白制品的質量控制與分子大小、結構特征、質量屬性復雜程度以及生產工藝相關。質量控制體系主要包括原輔料質量控制、包材、生產工藝和過程控制及制品檢定等。應通過終產品檢測、過程控制和工藝驗證結合的方法，確保各類雜質已去除或降低至可接受水平。制品質量控制包括采用標準物質和經驗證的方法評估已知和(或)潛在制品相關物質和工藝相關物質，以及采用適宜的方法對制品鑒別、生物學活性、純度和雜質等檢測進行分析。

3.1特性分析

研發階段以物理、化學和生物學方法對重組DNA蛋白制品的理化特性，生物學活件，免疫學特性，純度和雜質等進行嚴格的特性分析鑒定是確保產品安全有效,建立并確定制品質量標準的基礎。需采用廣泛的分析技術來展示目標分子的理化性質(分子大小、電荷、等電點、氨基酸組成、疏水性，以及對糖基化等各種翻譯后修飾進行充分鑒定，并納入適當的檢測,以確認制品具有預期的構象、聚集和(或)降解狀態及其高級結構。必要時，應采用新型分析技術用于特性分析。特性分析至少應包括以下范疇。

3.1.1

理化特性

3.1.1.1一級結構

級結構，即包括二硫鍵連接方式的氨基酸序列(包含二硫鍵的完整性和正確性、游離統基)。應盡可能采用綜合的方法測定目標制品的氨基酸序列，并與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進行比較。

氨基酸序列測定還應考慮可能存在的N端甲硫氨酸(如大腸埃希菌來源的制品),信號肽或前導序列和其他可能的N端、C端修飾(如乙酰化、酰胺化或者由于外肽酶導致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等),以及各種其他異質性(如脫酰胺化、氧化、異構化、碎片化、二硫鍵錯配、N-連接和O-連接的寡糖、糖基化、聚集等)。

3.1.1.2 糖基化修飾

應對糖基化修飾進行全面的分析和確定，如糖基化修飾與制品半衰期和生物學活性相關,則應確定糖的含量(如中性糖、氨基糖和唾液酸)。糖型結構可能與不良反應相關(如非人類的糖型結構或其殘基),應盡可能對糖鏈的結構、糖型以及多肽鏈的糖基化位點進行深入分析。必要時應進一步就電荷異質性進行檢測分析。

3.1.1.3高級結構

應通過適合的理化方法分析高級結構，并且通過生物學功能來確認。生物學活性是對高級結構的確證，也可采用體外或體內證實其治療功能的活性分析方法，作為高級結構確證的補充聚乙二醇修飾蛋白質的分析不僅限于平均修飾率，還應包括修飾位點等分析,

3.1.2生物學活性

生物學活性測定應基于制品實現確定的生物學效應的特定能力或潛力。可采用體外或體內方法或生物化學(包括免疫化學試驗)方法和(或)適宜的物理化學分析方法進行評估，如效價測定(以單位或國際單位表示)和(或)含量(以質量/重量表示)測定。

3.1.3 免疫化學特性

需全面說明制品的相關免疫學特性。應采用純化的抗原和抗原確定的區域進行結合實驗測定免疫學特性。必要時應確定親和力和免疫反應性(包括與其他類似結構蛋白的交又反應性)。應對目標分子中與相應表位作用的部分進行分析確證,包括對這些結構的生物化學鑒別(如蛋白質、低聚糖、糖蛋白、糖脂)和相關適合的特征研究(如氨基酸序列和糖型)。

糖基化和聚乙二醇化可能影響制品的藥理學性質和免疫原性，應進行適當的特性研究.

3.1.4 純度、雜質和污染物生物技術制品雜質主要包括制品相關雜質、工藝相關雜質以及外源污染物。應盡可能地對雜質進行分析鑒定，并采用適宜的方法評價其對生物學活性的影響。

3.1.4.1制品相關物質/雜質

制品相關物質/雜質主要源于生物技術制品異質性和降解產物。未端氨基酸異質性、電荷異質性、分子大小變異體以及包括糖基化在內的各類翻譯后修飾等異質性(如C端加工、N端焦谷氨酸化、脫酰胺化、氧化、異構化、片段化、二硫鍵錯配、N-連接和O-連接的賽、糖基化、聚集)可能導致其組成中存在幾種分子或變異體，應對目標制品的各種分子變異體進行分離、鑒別和分析，如變異體的活性與目標制品一致時，可不作為雜質。但應考慮在生產和(或)貯存期間產品降解產物是否顯著增加及其與免疫原性的相關性，

3.1.4.2 工藝相關雜質

工藝相關雜質包括來源于生產工藝本身，主要涉及細胞基質來源、細胞培養來源和下游工藝三個階段。應對潛在的工藝相關雜質(如宿主細胞蛋白質、宿主細胞DNA、細胞培養殘留物、下游工藝的殘留物等)進行鑒別、評估,并進行定性和(或)定量分析。

3.1.4.3 污染物

污染物系指所有引入日并非生產過程所需的物質(如各種微生物、細菌內毒素)。應嚴格避免引入污染物并對其進行相應控制。此外，還應考慮采用其他適宜檢測方法，對可能污染的包括肽聚糖等在內的"非細菌內毒素促炎性污染物“進行控制。

3.1.5 含量

應采用適宜的物理化學和(或)免疫化學方法進行含量測定。以適宜的參考品為對照，蛋白質含量(以質量或重量/體積表示)可通過合適的方法進行測定(如HPLC)。蛋白質含量也能通過一個絕對定量的方法測定,可采用第二種絕對定量的含量測定方法進行溯源和驗證,如果偏差太大,應考慮采用其他方法重新測定。

3.1.6 標準物質

應選擇已證明足夠穩定目適合臨床試驗的一個(多個)批次，或用一個代表批次作為標準物質,用于鑒別、理化和生物學活性等各種分析，根據重組DNA蛋白制品特性，應采用現有最先進的方法對標準物質做全面深入的表征/特性分析。標準物質的建立和制備可參照”生物制品國家標準物質制備和標定"的相關要求。

用于理化測定等方面的對照品,如用于肽圖或等電點測定的對照品,可用原液直接分裝制得,一般-70℃以下保存。根據重組DNA蛋白制品特性應對對照品進行必要的分析鑒定，包括蛋白質含量、比活性、等電點、純度、N端氨基酸序列、質譜分子量、波質肽圖、二硫鍵分析、糖基分析(真核表達)等。

3.2制品檢定

應根據制品特性確定制品檢定中需要進行的特性分析檢測項目。建立或驗證制品生產過程的有效件或可接受件的特件分析檢測項目可不納入常規質量控制中，但應對某一特定質量屬性是否放入常規放行標準予以說明

應根據一定數量的連續批次分析數據確定的批內和批間一致性分析數據，綜合臨床和非臨床研究，以及穩定性評價數據建立制品的質量標準，包括各種分析方法及具體數值限度、可接受標準范圍，以保證原液、成品或原材料在其生產的各階段符合其預期的質量要求。可接受標準的范圍確定應該考慮到所使用的分析方法的靈敏度。常規放行質量控制至少應包括以下方面。

3.2.1 鑒別

鑒別試驗應高度特異，并應基于分子結構和(或)其他特有的專屬件進行分析(如肽圖、抗獨特型免疫或其他適官的方法)。2根據制品特性，選擇理化、生物和(或)免疫化學中的一種或一種以上的檢測方法進行鑒別試驗。

3.2.2純度和雜質

應采用類似正交組合的方法來評估制品純度/雜質,并為制品相關的變異體建立單獨和(或)總體的可接受標準。質量控制中包括的工藝相關雜質的質量控制(如蛋白A、宿主細胞蛋白質、DNA、其他潛在的培養或純化殘留物等)通常在原液階段進行。如經充分驗證證明生產工藝對工藝相關雜質的去除已達到高水平時，工藝相關雜質的質量控制可在恰當工藝步驟的中間產物進行，可不列入常規放行檢定中。

3.2.3 效價

效價測定是以制品生物學特性相關屬性為基礎的生物學活性定量分析,原則上效價測定方法應盡可能反映或模擬其作用機制。比活性(每筆克制品具有的生物學活性單位)對證明制品的一致性具有重要的價值。

應采用適宜的國家或國際標準品或參考品對每批原液和成品進行效價測定。尚未建立國際標準品/國家標準品或參考品的，應采用經批準的內控參比品。標準品和參考品的建立或制備應符合"生物制品國家標準物質制備和標定"

3.2.4 含量

采用適宣方法和參考品作為對照，測定原液和成品的含量，

3.2.5安全性試驗

應根據相關制品的各論視情況而定。檢測應至少包括無菌、細菌內毒素、異常毒性檢查等。

3.2.6 其他檢測項目

應根據相關制品的特性而定。檢測應包括外觀(例如性狀、顏色)、可見異物及不溶性微粒檢査,溶解度、pH值、滲透壓摩爾濃度、裝量、穩定劑和水分測定等。

3.3包裝及密閉容器系統

應對原液和成品與容器的相容性、容器吸附、制品和包裝材料之間的漫出進行檢測和確認,以避免蛋白質和制劑輔料和(或)容器包裝系統發生相互作用，導致對制品的安全件和有效件帶來潛在風險，此外，應采用適宜方法對容器完整件進行檢測,防止容器泄漏導致產品無藁狀態的破壞。

4 貯存、有效期和標簽

自生產之日起，按批準的有效期執行。制品貯存應符合“生物制品分包裝及貯運管理”規定，成品應在適合的環境條件下貯存和運輸。標簽應符合"生物制品分包裝及貯運管理”要求和國家相關規定，標示內容至少應包括:

(1)每瓶或每1ml的活性單位(如必要);

(2)每瓶有效成分含量和(或)蛋白質含量;

(3)每瓶標示體積;

(4)凍干制劑復溶液體的名稱、體積及復溶后的使用期限;

(5)使用前進行適量稀釋(如果需要);

(6)有效期。

來源：藥典委