附件：9251 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則草案公示稿（第一次）

 9251 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則是對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的內(nèi)容及應(yīng)用做進(jìn)一步的說(shuō)明。

1. 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的設(shè)定

   產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值一般是通過(guò)公式 L=K/M 計(jì)算得到的。其中 M 為人用每千克體重每小時(shí)最大供試品劑量，可參考藥品說(shuō)明書(shū)或具有權(quán)威性資料的用法用量。

   制定品種細(xì)菌內(nèi)毒素限值時(shí)，應(yīng)考慮以下情況。

（1）聯(lián)合用藥應(yīng)考慮其他制劑可能引入的細(xì)菌內(nèi)毒素；兒科用藥、營(yíng)養(yǎng)不良用藥和惡病質(zhì)用藥等，應(yīng)考慮細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)體弱患者人群可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的影響。因此，制定上述品種細(xì)菌內(nèi)毒素限值時(shí)，可在計(jì)算值的基礎(chǔ)上適當(dāng)嚴(yán)格。

（2）100ml 及以上裝量的大輸液類制劑，其細(xì)菌內(nèi)毒素限值一般不得超過(guò) 0.50EU/ml。

（3）制定具有多種規(guī)格注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值時(shí)，限值的單位應(yīng)與產(chǎn)品臨床用法用量（M）的標(biāo)示單位一致，如 EU/mg、EU/U 或 EU/ml。

（4）注射或植入眼內(nèi)的藥物產(chǎn)品，其細(xì)菌內(nèi)毒素限值一般不得超過(guò) 2.0 EU/劑。眼科沖洗產(chǎn)品的內(nèi)毒素限值一般不得超過(guò) 0.5 EU/ml。制定原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素限度值時(shí)，應(yīng)參考其制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。

（4）制定原料藥的細(xì)菌內(nèi)毒素限度值時(shí)，應(yīng)參考其制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素限.

（5）制定原輔料和藥包材的細(xì)菌內(nèi)毒素限值時(shí)，應(yīng)根據(jù)制劑內(nèi)毒素控制的要求，基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，采用具體問(wèn)題具體分析的原則。應(yīng)根據(jù)其在制劑中的用量，結(jié)合生產(chǎn)工藝，評(píng)估各組分對(duì)制劑引入細(xì)菌內(nèi)毒素污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，合理分配每一種成分和藥包材的內(nèi)毒素限值。以確保即使每種成分和藥包材細(xì)菌內(nèi)毒素污染達(dá)到其限值，按照批準(zhǔn)的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的制劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查仍符合規(guī)定。

2. 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的選擇

   細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（通則 1143）包括凝膠法檢測(cè)和光度檢測(cè)技術(shù)法共 6種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。供試品檢測(cè)時(shí)可以選用其中任何一種方法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

（1）凝膠法檢測(cè)技術(shù) 凝膠法檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，供試品在排除干擾作用后均可使用凝膠法檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。

   凝膠法檢測(cè)技術(shù)的干擾試驗(yàn)是確定供試品能否使用凝膠法檢測(cè)技術(shù)的決定因素。進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)挑選與鱟試劑反應(yīng)呈陰性的樣品進(jìn)行。

   若樣品稀釋到 MVD 仍不能排除干擾作用，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)供試品的前處理進(jìn)行研究，再用干擾試驗(yàn)驗(yàn)證能否使用凝膠法檢測(cè)技術(shù)。

（2）光度法檢測(cè)技術(shù) 光度法檢測(cè)技術(shù)（包括濁度法和顯色法）可定量檢測(cè)內(nèi)毒素的含量，能較為準(zhǔn)確評(píng)估產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中污染的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)，定量檢測(cè)的數(shù)據(jù)不僅有利于追蹤產(chǎn)品質(zhì)量趨勢(shì)，還能起到風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的作用，達(dá)到數(shù)據(jù)完整性的要求。

   供試品能否采用光度法檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，須通過(guò)干擾試驗(yàn)確定。光度法檢測(cè)技術(shù)測(cè)定法可通過(guò)回收率判斷出干擾的趨勢(shì)，尤其對(duì)于研究性質(zhì)的樣品（如新產(chǎn)品）更具有優(yōu)勢(shì)。

   由于光度法檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)范圍比凝膠法檢測(cè)技術(shù)寬，使得有干擾的樣品可以有更大的稀釋倍數(shù)，對(duì)于部分使用凝膠法檢測(cè)技術(shù)無(wú)法排除干擾的樣品，可以嘗試使用光度法檢測(cè)技術(shù)建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法。

       3.供試品的前處理方法

   除另有規(guī)定外，一般應(yīng)使用內(nèi)毒素檢查用水（BET 水）溶解或稀釋樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。常見(jiàn)的干擾因素和排除干擾的前處理方法見(jiàn)表 1。

在水中溶解度低的樣品可以采取超聲波、加熱助溶、添加助溶劑、調(diào)節(jié)pH 等方法提高其溶解度。當(dāng)采用適宜的有機(jī)溶劑（乙醇、DMSO 等）進(jìn)行溶解時(shí)，必須進(jìn)行干擾試驗(yàn)驗(yàn)證內(nèi)毒素的回收。

難溶性或溶解度較低的樣品可依據(jù)樣品特性，選擇適宜的方法進(jìn)行前處理，前處理包括樣品的溶解和干擾的排除。樣品的溶解方法可采用調(diào)節(jié) pH 、加熱、超聲、添加助溶劑等方式溶解，也可采用有機(jī)溶劑溶解；溶解后干擾的排除方法可采用內(nèi)毒素檢查用水稀釋、酸堿緩沖液稀釋、超濾、萃取等方式。當(dāng)采用上述方法進(jìn)行供試品前處理時(shí)，應(yīng)在供試品或供試品溶液中預(yù)先添加內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，再與供試品同步處理后進(jìn)行干擾試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證前處理方法不會(huì)對(duì)內(nèi)毒素產(chǎn)生破壞或干擾作用。供試品前處理所用試劑的內(nèi)毒素含量應(yīng)對(duì)試驗(yàn)無(wú)影響。采用包合技術(shù)的新型制劑如微球、脂質(zhì)體等供試品，應(yīng)采取適宜方法將包合體破壞，使包裹在內(nèi)部的細(xì)菌內(nèi)毒素完全釋放，再進(jìn)行檢測(cè)。

對(duì)于容器類藥包材一般采用加入標(biāo)示容量的內(nèi)毒素檢查用水浸泡容器內(nèi)腔的方法進(jìn)行供試液制備；對(duì)于非容器類的藥包材，應(yīng)將藥包材置于無(wú)熱原玻璃器皿內(nèi)，一般加入不超過(guò) 40mL 的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)行供試液制備，其中針對(duì)體積較大或者較小的藥包材，可以相應(yīng)的增加或者減少提取液的體積，同時(shí)在內(nèi)毒素限量值方面做出相應(yīng)的調(diào)整。對(duì)于無(wú)菌供應(yīng)的藥包材，應(yīng)采用 37℃±1℃，提取不少于 1h 的條件制備供試液；對(duì)于非無(wú)菌供應(yīng)的包裝無(wú)菌藥品的藥包材，應(yīng)按照所包裝制劑推薦的滅菌條件進(jìn)行供試液制備。

4.產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立

建立品種的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法時(shí)，為驗(yàn)證樣品和不同生產(chǎn)廠家鱟試劑反應(yīng)的一致性，應(yīng)使用兩個(gè)生產(chǎn)廠家的鱟試劑對(duì)至少三批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

建立產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法時(shí)，若無(wú)法排除供試品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾作用，或只能使用最高靈敏度鱟試劑（凝膠法檢測(cè)技術(shù)為 0.03EU/ml，光度法檢測(cè)技術(shù)為 0.001EU/ml）才能排除干擾，則該品種不宜建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)。

5.其他

 5.1實(shí)驗(yàn)時(shí)，當(dāng)使用規(guī)格大于 0.1ml/支裝量的鱟試劑時(shí)，為避免鱟試劑支間活性差異帶來(lái)的影響，可將鱟試劑復(fù)溶后混合，再分裝到反應(yīng)容器中使用。凝膠法檢測(cè)技術(shù)常用的反應(yīng)容器為適宜的玻璃小試管或空安瓿等，光度法檢測(cè)技術(shù)常用的反應(yīng)容器為測(cè)定儀專用試管或酶標(biāo)板。塑料材質(zhì)可能會(huì)引起干擾，使用前應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。

5.2 采用凝膠法檢測(cè)技術(shù)檢驗(yàn)時(shí)，如果計(jì)算出的 MVD 值不是整數(shù)，可以使用小于 MVD 的整數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，為判斷產(chǎn)品是否合格，需采用計(jì)算的 MVD 重新測(cè)試。當(dāng)遇到不合格結(jié)果時(shí)，應(yīng)進(jìn)行全面的回顧調(diào)查，確定試驗(yàn)的有效性。為了獲得不合格供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素含量值，凝膠檢測(cè)和光度檢測(cè)中均可以采用超過(guò) MVD 的稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。

目前新的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法不斷出現(xiàn)，以適應(yīng)特殊品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的需要，或減少鱟試劑的使用量。

5.3 供試品和鱟試劑的加樣量一般為 0.1ml，也可采用其他加樣量進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)，如采用小于 0.1ml 加樣量開(kāi)展凝膠試驗(yàn)，或采用其他加樣量進(jìn)行動(dòng)態(tài)顯色法。動(dòng)態(tài)顯色法加樣體積、預(yù)設(shè) OD 值、所用微孔板等，應(yīng)參照試劑生產(chǎn)商的相關(guān)說(shuō)明使用。如采用的加樣量較小時(shí)，實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性更容易受試驗(yàn)操作、環(huán)境污染、試管孔徑（如凝膠試驗(yàn)因所用的試管孔徑較小而受表面張力影響，使鱟試劑與樣品的反應(yīng)混合物流動(dòng)較慢，易被誤判為凝膠形成，

應(yīng)注意觀察）等外界條件的影響，因此對(duì)試驗(yàn)人員的操作水平和環(huán)境的清潔度有較高的要求。結(jié)果如有爭(zhēng)議時(shí)，可采用加樣量為 0.1ml 的凝膠限度實(shí)驗(yàn)進(jìn)行仲裁。

5.4 低內(nèi)毒素回收，也稱為內(nèi)毒素掩蔽，是指無(wú)法使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法正常檢測(cè)到無(wú)菌制劑 （特別是蛋白類生物制劑）中的加標(biāo)內(nèi)毒素的現(xiàn)象。判斷低內(nèi)毒素回收的方法是將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素添加到未稀釋的樣品中，隨著時(shí)間的推移，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的回收率無(wú)法達(dá)到≥50％。低內(nèi)毒素回收會(huì)導(dǎo)致樣品中的內(nèi)毒素污染水平可能被低估或未被檢測(cè)出。該現(xiàn)象無(wú)法通過(guò)稀釋來(lái)排除，需要在建立樣品內(nèi)毒素檢測(cè)方法時(shí)進(jìn)行研究。

對(duì)于存在低內(nèi)毒素回收現(xiàn)象的產(chǎn)品，可通過(guò)調(diào)整樣品處理或試驗(yàn)方法來(lái)恢復(fù)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)能力。緩解低內(nèi)毒素回收的措施應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品本身特性，采用在樣品中添加分散劑、添加過(guò)量的二價(jià)金屬離子、使用有機(jī)溶劑增加樣品的疏水性等方式。如無(wú)法緩解低內(nèi)毒素回收現(xiàn)象，應(yīng)采用熱原檢查法或其他替代方法。

5.5 重組 C 因子法（見(jiàn)本通則附：重組 C 因子法）、微量凝膠法等為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的補(bǔ)充方法。當(dāng)采用重組 C 因子法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（通則 1143）中未收載的方法檢測(cè)產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素時(shí)，應(yīng)符合“凡例”的相關(guān)規(guī)定。

附重組 C 因子法

C 因子是鱟試劑中對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠選擇性識(shí)別內(nèi)毒素。重組 C 因子是一種人工合成的 C 因子，它被細(xì)菌內(nèi)毒素活化后，可與熒光底物作用產(chǎn)生與內(nèi)毒素濃度成比例的熒光信號(hào)。

本法系依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)毒素濃度和其孵育終止時(shí)的熒光值之間存在量化關(guān)系來(lái)測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素的含量。本法為終點(diǎn)熒光法。依據(jù)檢測(cè)原理， 本法不存在 G 因子旁路干擾，具有較高的專屬性，因此適合于含有β葡聚糖干擾的樣品檢測(cè)；本法所用試劑不含有 B 因子和凝固酶原、凝固蛋白原等，因此含有對(duì)上述物質(zhì)抑制或增強(qiáng)作用的樣品適合使用重組 C 因子法。

重組 C 因子法試驗(yàn)需采用熒光酶標(biāo)儀，其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)等參數(shù)參照試劑的使用說(shuō)明書(shū)，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)一般為：380nm/440nm，檢測(cè)溫度一般為 37℃±1℃。儀器靈敏度（增益值）調(diào)節(jié)、重組 C 因子試劑的配制方法、保溫時(shí)間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說(shuō)明進(jìn)行。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)、干擾試驗(yàn)、檢查法以及結(jié)果判斷 參照細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（通則 1143）中的方法 2 光度法檢測(cè)技術(shù)。

起草單位：中國(guó)食品藥品檢定研究院 聯(lián)系電話：010-53851594

9251 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則修訂說(shuō)明

本次修訂的主要內(nèi)容說(shuō)明如下：

1.在“細(xì)菌內(nèi)毒素限值的設(shè)定”項(xiàng)下，參考 USP 1085，新增了眼科用藥的內(nèi)毒素限值制定；將原料、輔料、包材限度制定綜合考慮制定要求。

2.在“供試品的前處理方法”項(xiàng)下，參考 USP 1085，增加了常見(jiàn)的干擾和排除措施；對(duì)難溶性樣品的前處理方法和要求，進(jìn)行詳細(xì)描述；增訂藥包材樣品的前處理方法。

3.在“其他”項(xiàng)下，提出使用塑料材質(zhì)試管需先進(jìn)行驗(yàn)證的要求；參考USP 1085，增加當(dāng)遇到不合格結(jié)果時(shí)的相關(guān)建議；增加當(dāng)采用小于 0.1ml 加樣量開(kāi)展內(nèi)毒素試驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題；增加對(duì)低內(nèi)毒素回收現(xiàn)象的描述，以及處理方法的介紹；明確重組 C 因子法為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法補(bǔ)充方法。

4.全文依據(jù) 1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法 的修訂，對(duì)本文中凝膠試驗(yàn)和光度試驗(yàn)的方法名稱進(jìn)行相應(yīng)的修改。

來(lái)源：藥典委

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