藥包材細胞毒性試驗方法系將供試品或供試品溶液接觸細胞，通過對細胞形態、增殖和抑制影響的觀察，評價供試品對體外細胞的毒性作用。

試驗用細胞 推薦使用小鼠成纖維細胞 L-929。試驗時采用傳代 48～72 小時生長旺盛的細胞。

試驗前的準備 與樣品及細胞接觸的所有器具均需無菌。必要時可采用濕熱滅菌，如 115℃保持 30 分鐘；干熱滅菌，如 250℃保持 30 分鐘或用 180℃保持2 小時。供試品溶液的制備 取供試品，按照“藥包材生物學評價與試驗選擇指導原則（9651）”中生物學試驗的要求制備供試品溶液。

第一法 相對增殖度法

陰性對照液制備 為不加供試品的細胞培養液。

陽性對照液制備 取陽性參比物，按照供試品溶液的制備項下的規定進行，也可使用 6.3%苯酚的細胞培養液。

試驗方法 取 33 個培養瓶，分別加入 4×10 16 4個/mL 濃度的細胞懸液 1mL，細胞培養液 4mL，在 37℃±1℃，5%±1%CO2的條件下培養 24 小時。培養 24 小時后棄去原培養液。

陰性對照組： 取 13 個培養瓶分別加入 5mL 陰性對照液；

陽性對照組： 取 10 個培養瓶分別加入 5mL 陽性對照液。

供試品組： 取 10 個培養瓶分別加入 5mL 含 50%供試品溶液的細胞培養液，在 37℃±1℃，5%±1% CO2條件下繼續培養 7 天。

細胞形態學觀察和計數：在更換細胞培養液的當天，取 3 瓶陰性對照組，并在更換后第 7 天，每組各取 3 瓶進行細胞形態觀察和細胞計數。

毒性評定 細胞形態分析標準按表 1 規定進行。

     細胞相對增殖度分級標準按表 2 規定進行。

結果評價 供試品組相對增殖度（以第 7 天的細胞濃度計算）為 0 級或 1級判為合格。試驗組相對增殖度為 2 級，應結合形態綜合評價，輕微毒或無毒的判為合格。試驗組相對增殖度為 3～5 級判為不合格。

第二法 瓊脂擴散法

本法適用于彈性體細胞毒性的測定。當聚合物供試品中可濾取的化學物質擴散時，瓊脂層可起到隔墊的作用保護細胞免受機械損傷。供試品溶液將通過一張濾紙（表面積不小于 100mm 37 2）進行試驗。

陰性對照制備 取陰性參比物，例如高密度聚乙烯，按照供試品溶液的制備項下的規定進行。

陽性對照制備 取陽性參比物，例如二乙基二硫代氨基甲酸鋅的聚氨酯（ZDEC），按照供試品溶液的制備項下的規定進行。可采用 10%二甲基亞砜（DMSO）溶液，附著到生物惰性吸收性（例如超細硼硅玻璃纖維濾紙）的基質上。

試驗方法 取細胞懸浮液（1×10 44 5個/mL）7mL，均勻分散至直徑 60mm 的培養皿中。置于 37℃±1℃，含 5%±1% CO2氣體的細胞培養箱中培養 24 小時至近匯合單層細胞，棄去培養皿中培養基，將溶化瓊脂冷卻至 48℃左右與含 20%血清的2倍新鮮哺乳動物細胞培養基混合，使瓊脂最終質量濃度不大于 2%，在每只培養皿內加入新制備的含瓊脂培養基（要足夠薄以利于可瀝濾物的擴散）。

含瓊脂培養基凝固后，可用適當的染色方法染色。將供試品、陰性對照、陽性對照小心地放在培養皿的固化瓊脂層表面。

每個供試品、陰性對照、陽性對照試樣間盡量保持合適的距離并遠離培養皿壁，每一培養皿中放置不超過 3 個試樣，每個試樣至少設置 2 個平行。置37℃±1℃，5%±1%CO2的細胞培養箱中至少培養 24 小時±2 小時。用顯微鏡觀察每個供試品、陰性對照、陽性對照試樣反應區域。用活體染料，如中性紅有助于檢測細胞毒性。

結果評價 按表 3 進行細胞毒性評價和分級。如陰性對照為 0 級（無毒）、

      陽性對照不小于 3 級（中度毒），則細胞培養試驗系統有效。

供試品和/或供試品溶液細胞毒性分級不大于 2 級（輕度毒）時，則判為合格。

第三法 直接接觸法

供試品制備 采用供試品的平整部分，表面積不小于 100mm 62 2。

陰性對照制備 取陰性參比物，例如高密度聚乙烯，按與供試品相同方式制備。

陽性對照制備 取陽性參比物，與供試品相同方式制備。

試驗方法 取生長旺盛的細胞懸浮液（1×10 66 5個/mL）2mL，置直徑 35mm 的

平皿中培養單層細胞。置于細胞培養箱中培養 24 小時至近匯合單層細胞，吸去培養基，替換為 0.8mL 的新鮮培養基。

在每個培養皿中單獨放置 1 個供試品、陽性對照或陰性對照，每個試樣至少設置 2 個平行。將所有的培養物置 37℃±1℃含 5%±1%CO2的細胞培養箱中至少培養 24 小時，培養箱宜保持適當的濕度。顯微鏡下觀察每個供試品、陰性對照、陽性對照周圍，必要時應進行染色。

結果評價 按照瓊脂擴散法結果評價項下的規定進行。若樣品不超過 2 級（輕度毒），則樣品判為合格。若試驗系統無效需重復試驗過程。

 第四法 浸提法

陰性對照制備 取陰性參比物，例如高密度聚乙烯，按照供試品溶液的制備項下的規定進行。

陽性對照制備 取陽性參比物，按照供試品溶液的制備項下的規定進行

試驗方法 取生長旺盛的細胞懸浮液（1×10 79 5 個/mL）2mL，置直徑 35mm的平皿中培養單層細胞。培養不少于 24 小時至細胞至少達到 80%近匯合后，吸去培養基，替換為供試品溶液、陰性對照液或陽性對照液。含血清培養基提取液和不含血清培養基提取液無需稀釋，平行試驗 2 份。0.9%氯化鈉注射液為介質的提取液用含血清的細胞培養基稀釋至提取液濃度為 25%，平行試驗 2 份。所有的培養物在 37℃±1℃，含 5%±1%CO2的培養箱中培養 48 小時。48 小時后，在顯微鏡下觀察培養物，如有必要，進行染色。

結果評價 按表 4 進行毒性評價和分級。若試驗系統不成立，重復試驗。供試品不超過 2 級（輕度毒），則判為合格。如需進行劑量-反應程度評價，可通過定量稀釋樣品提取液，重復試驗。

來源：藥典委會員會

附4-藥包材細胞毒性試驗方法 .pdf