3516 抗人T細(xì)胞免疫球蛋白效價測定法(淋巴細(xì)胞毒試驗)

本法系依據(jù)抗人T細(xì)胞免疫球蛋白與人淋巴細(xì)胞結(jié)合,在補體存在下破壞淋巴細(xì)胞,根據(jù)淋巴細(xì)胞死亡率測定供試品抗人T細(xì)胞免疫球蛋白效價。

試劑 (1)淋巴細(xì)胞分離液(Ficol's液)

(2)Hank's液。

(3)20%胎牛血清Hanks液 試驗當(dāng)天取適量經(jīng)消毒保存的Hank's液,加入經(jīng)56℃、30分鐘滅能的胎牛血清,配成20%濃度。用0.5mol/碳酸氫鈉溶液或稀鹽酸調(diào)pH值至7.2~7.4。

(4)淋巴細(xì)胞懸液 取肝嘉抗凝新鮮人靜脈血加等量0.85%~0.90%氨化鈉溶液混勻后,緩慢加至等量淋巴細(xì)胞分離波液面上,以每分鐘2000轉(zhuǎn)離心20分鐘，吸出淋巴細(xì)胞層細(xì)胞，加話是0.85%~090%氧化穎溶波清洗，以每分鐘1200轉(zhuǎn)離心10分鐘，在上清波，沉淀加入話是20%胎生血清Hank'液，搖勻，為淋巴細(xì)胞原液:用1%醋酸藍(lán)液將淋巴細(xì)胞原液稀釋20倍,鏡檢計數(shù)淋巴細(xì)胞。根據(jù)計數(shù)結(jié)果,用20%胎牛血清Hank's液將淋巴細(xì)胞原液稀釋成每1ml含5x10⁶個淋巴細(xì)胞，即為淋巴細(xì)胞懸液。

(5)補體 采用正常家兔血清。作補體用的兔血清應(yīng)對試驗用的靶細(xì)胞無明顯的毒性,因此家兔血清要預(yù)先進(jìn)行選擇,方法如下:取淋巴細(xì)胞懸液0.05ml，加1:5稀釋的家兔血清0.05ml,置37℃、1小時后,加0.5%臺盼藍(lán)生理氣化鈉溶液0.05ml,置37℃、5分鐘后鏡檢計數(shù)淋巴細(xì)胞,死亡細(xì)胞率在10%以下者方可作補體用。

(6)0.5%臺盼藍(lán)生理氯化鈉溶液。

(7)2.5%戊二醛溶液(用Hank's液稀釋)。

供試品溶液的制備根據(jù)供試品效價 用20%胎牛血清Hank's液將供試品稀釋至幾個適宜濃度。

陽性對照溶液的制備 將經(jīng)人T淋巴細(xì)胞免疫的豬血漿或兔血清在60℃加熱10分鐘后,用0.85%~0.90%氨化鈉溶液稀釋10倍。

陰性對照溶液的制備 將正常豬血漿或兔血清在60℃加熱10分鐘后,用0.85%~0.90%氨化鈉溶液稀釋10倍。

測定法 取供試品溶液0.05ml,加淋巴細(xì)胞懸液0.05ml,置37℃、1小時,加1:5稀釋的家兔血清0.05ml,置37℃、30分鐘后加0.5%臺盼藍(lán)生理氯化鈉溶液0.05ml,置37℃、5分鐘,立即鏡檢計數(shù)淋巴細(xì)胞,計算死亡細(xì)胞率,一般數(shù)100個淋巴細(xì)胞。取陽性對照溶液0.05m1,加淋巴細(xì)胞懸液0.05ml,自"置37°℃、1小時"起,同法操作,作陽性對照。取陰性對照溶液0.05ml,加淋巴細(xì)胞懸液0.05ml,自“置37℃、1小時"起,同法操作,作陰性對照。

結(jié)果判定 陽性對照組的死亡淋巴細(xì)胞率大于20%,且陰性對照組的死亡淋巴細(xì)胞率小于10%,試驗成立。以(+)為判定終點，出現(xiàn)(+)供試品的最高稀釋度為該供試品的淋巴細(xì)胞毒效價，

【附注】(1)試驗組死亡淋巴細(xì)胞率

小于10%(-)41%-60%(++)

10%~20%(±)61%~80%(+++)

21%-40%(+)不低于81%(++++)

(2)如供試品較多或來不及看結(jié)果時,為避免試驗誤差,可在抗原、抗體、補體作用后加0.5%臺盼藍(lán)生理氣化鈉溶液0.05ml,置37°C、5分鐘后立即加2.5%戊二醛溶液0.05ml,留待適當(dāng)時候鏡檢;或先加2.5%戊二醛溶液0.05ml,室溫放置10分鐘后,加入0.5%臺盼藍(lán)生理氨化鈉溶液0.05ml置37℃℃，5分鐘后留待適當(dāng)時候鏡檢。

來源：藥典委