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新版細胞毒性檢查法——瓊脂擴散法

2019-10-29 10:20

細胞毒性是化學物質(藥物)作用于細胞基本結構和/或生理過程,如細胞膜或細胞骨架結構,細胞的新陳代謝過程,細胞組分或產物的合成、降解或釋放,離子調控及細胞分裂等過程,導致細胞存活、增殖和/或功能的紊亂,所引發的不良反應。

HDPE瓶.jpg

高密度聚乙烯瓶


供試品制備  將樣品用純化水沖洗干凈(根據實際情況需要),用濾紙吸干。

若用供試品液進行試驗,將制備的供試品液附著到生物多性吸收性的基質(例如超細硼硅玻璃纖維濾紙)上,支撐面積不少于100個單位的圓形供試品。

陰性對照制備 取生物毒性參比物質,例如:高密度聚乙烯。按照供試品制備項下的規定進行。

陽性對照制備  取生物毒性陽性參比物質,例如含二乙基二硫代氨基甲酸鋅的聚氨酯(ZDEC)。按照供試品之輩項下的規定進行。可采用10%二甲基亞砜(DMSO)溶液,附著到生物惰性吸收性的基質上。


檢查法

取細胞懸浮液(1X105/ml7ml,均勻分散至直徑60mm的培養皿中。置于含(5±1)%CO2氣體的西跑培養箱中培養24h至匯合單層細泡,棄去培養皿中培養基,將融化瓊脂冷卻至48度左右與含20%血清的2倍新鮮哺乳動物細胞培養基混合,使瓊脂最終質量濃度不大于2%,在每只培養皿內加入新制備的含瓊脂培養基(要足夠博以利于可瀝濾物的擴散)。

防潮醫藥包裝.jpg

防潮醫藥包裝


含瓊脂培養基凝固后,可適當的的染色方法染色,將供試品、陰性對照、陰性對照小心地放在培養皿的固化瓊脂層表面。


每個供試品、陰性對照、。陽性對照試樣間盡量保持合適的距離并遠離培養皿壁,每一培養皿中放置不超過3個試樣,每個試樣至少設置2個平行,置(37±1)度含(5±1)%CO2的細胞培養箱中至少培養(24±2)h。培養箱宜保持適當的溫度。用顯微鏡觀察每個供試品、陰性對照、陽性對照試樣反應區域。用活體染料如中性紅可有助于檢測細胞毒性。

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結果評價 進行細泡毒性評價和分級,對照下表陰性對照為0級(無毒)、陽性對照不小于3級(中度毒),則細胞培養試驗系統有效。檢測提取液時,供試品液的反應區域應減去介質對照的反應區域,再進行毒性分級。供試品和或供試品液細胞毒性大于2級(輕度毒)以上時,則判為合格。  


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